有没有人知道ABI 3730测序仪的测序原理,有没有人知道ABI 3730测序仪的测序原理
1、有没有人知道ABI 3730测序仪的测序原理
就是用某种类似pcr产生的单链不同大小的dna在很长的毛细管里跑page胶，不同大小的单链dna上3’端有荧光，跑到发射激光的位置激光1打机器就看见荧光了，根据荧光不同来判断是什么碱基，大约能测到800bp左右。
2、有没有人知道ABI 3730测序仪的测序原理
就是用某种类似pcr产生的单链不同大小的dna在很长的毛细管里跑page胶，不同大小的单链dna上3’端有荧光，跑到发射激光的位置激光1打机器就看见荧光了，根据荧光不同来判断是什么碱基，大约能测到800bp左右。
3、DNA测序仪
这是我在网上找来的，自己感觉说的挺全的，你看看。
不过我要说1句，目前DNA测序所依靠的还是Sanger的原理，只是结合了荧光染料，提高了灵敏度。
DNA测序原理和方法
DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的1种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的4色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得4种荧光染料的测序 PCR产物可在1根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是1台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均1，避免了配胶条件不1致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为 10～40min。
由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
【试剂与器材】
1．BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利4色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。
2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。
3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。
4．DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。
5．引物 需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6．灭菌去离子水或3蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离，PE公司产品。
8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。
9．70%乙醇和无水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。
11．POP 6测序胶 ABI产品。
12．模板抑制试剂(TSR) ABI产品。
13．10×电泳缓冲液 ABI产品。
14．ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。
15．2400型或9600型PCR仪。
16．台式冷冻高速离心机。
17．台式高速离心机或袖珍离心机。
【操作步骤】
1．PCR测序反应
(1) 取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待测的质粒DNA 1μl －
pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1μl
待测DNA的正向引物 1μl －
M13(-21)引物 － 1μl
灭菌去离子水 2μl 2μl
总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
2．醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3．电泳前测序PCR产物的处理。
(1) 加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。
(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。
4．上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下1样品，预电泳和电泳。每1个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
5．仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6．测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
【计算】
测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%
差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。
【注意事项与评价】
1．ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。
2．本实验测序PCR反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4～4.5μl，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。
3．作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，1个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，1般PCR产物需30～90ng，单链DNA需50～100ng，双链DNA需200～500ng，DNA的纯度1般是A260nm/A280nm为 1.6～2.0，最好用去离子水或3蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或3蒸水配成3.2pmol/μl较好。
4．本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，1般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为 (98.5±0.5) %，仪器不能辨读的碱基N＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同1模板进行测序，相互印证。对于N碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进1步核对。
4、DNA测序仪已发展到第几代了？什么时候人们才开始关注DNA测序的？国内外的DNA测序仪发展的现状？
测序仪市场在用的，到第3代测序仪。
第1个测序实验是Sanger于1960s进行，于1976年正式出现第1台商用测序仪。为第1代测序仪；
国内外主流测序仪主要有以下几种：
第1代测序仪：ABI 的3730XL型号测序仪，测序原理是sanger法测序；
第2代测序仪：illumina的MiSeq、NextSeq、HiSeq等系列型号测序仪；ion torrent的ion Proton测序仪；ABI的SOLID测序仪（已不在中国供货）；罗氏的454测序仪（已于2013年底停产）；
第3代测序仪：CG公司的CG测序系统（2013年被华大基因收购，有人认为CG不属于第3代测序仪）；太平洋生物公司的PacBio RSII测序仪等。
5、1代测序技术包括哪些？
包括Sanger测序，STR亲子鉴定、法医鉴定，SnaPshot测序技术，实时荧光定量PCR。上个世纪末90年代，与“曼哈顿原子弹计划”和“阿波罗登月计划”具有同样划时代意义的“人类基因组计划”启动，这是人类第1次在分子水平上全面地认识自我。随着人类基因组计划的开展，人们对基因与疾病的关系认识更加深入，有机会通过对基因缺陷的检测分析来判断各种疾病发生的风险，并由此衍生出1种新的健康服务项目—基因测序。Sanger测序经过38年的发展已相当完善，成本也降低了10倍以上，现在国际上仍然是基因测序行业的金标准和主力军。sanger测序是目前所有基因测序的国际金标准，是包括荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、芯片法、2代测序法、质谱法等方法的金标准。2010年以来，出现了很多新1代测序仪产品，新1代测序成本低、数据大、速度快，但都有待成熟，准确度不够高。（1）、Sanger测序被检测的DNA碱基顺序依次读出800bp以上，是1代所有测序和新1代所有测序的金标准。代表仪器美国ABI3730XL，Sanger测序1般医院很少开展，开展的都发公司做。耗时长达 13年之久的人类基因组计划也是依靠Sanger测序法才得以最终完成的。Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 扩增直接测序。单个突变点的扩增（包括该位点在内的外显子部分片段的扩增），不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。所以单基因或部分基因控制的疾病样本检测，Sanger 测序可以发挥精准和成本低的优势。（2）、STR亲子鉴定、法医鉴定通过测定DNA片段的长度和颜色，来确定遗传关系。是sanger测序技术基础上，发展起来的1个技术，所用仪器与sanger测序所用仪器1样，检测原理1样，1台设备装两套检测软件，1台仪器具有3个功能。代表仪器美国ABI
3130、3130XL、3730仪器，1般司法机构和sanger测序公司拥有该仪器，医院没有。亲子鉴定就是通过对DNA遗传片段检测，判定父母与子女之间的亲缘关系。（3）、SnaPshot测序技术SNaPshot技术是美国应用生物公司（ABI）开发，是荧光标记单碱基延伸的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP突变分型项目检测。通常用于10~30个SNP突变位点分析。是sanger测序技术基础上，发展起来的1个技术，和sanger测序仪器1样，检测原理1样，1台设备装有两套检测软件，1台仪器具有3个功能。代表仪器美国ABI
3130、3130XL、3730仪器，1般sanger测序公司拥该有仪器。优势：
1、分型准确，
2、通量高，
3、检测速度快，
4、不受SNP位点多态性特性限制，
5、不受样本个数限制。SNaPshot技术是新1代测序技术（包括2代测序和芯片测序）SNP突变检测的金标准，sanger测序技术又是SNaPshot技术突变检测的金标准。（4）、实时荧光定量PCR利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线（或者与内参对照）对未知模板进行定量分析。代表仪器美国ABI 7500荧光定量PCR仪等，1般3甲医院都有该类仪器，普及较好。使用方便维护简单。
1、突变寻找：定量PCR TaqMan探针杂交。
2、基因定量：相对荧光定量PCR，医学上用来检测细菌或病毒RNA的表达量。荧光定量PCR是1996 年由美国ABI 公司推出的1种新定量实验技术。实时荧光定量PCR应用领域：临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价，地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测，肿瘤标志物及瘤基因测序，遗传基因测序。
6、DNA测序仪已发展到第几代了？什么时候人们才开始关注DNA测序的？国内外的DNA测序仪发展的现状？
测序仪市场在用的，到第3代测序仪。
第1个测序实验是Sanger于1960s进行，于1976年正式出现第1台商用测序仪。为第1代测序仪；
国内外主流测序仪主要有以下几种：
第1代测序仪：ABI 的3730XL型号测序仪，测序原理是sanger法测序；
第2代测序仪：illumina的MiSeq、NextSeq、HiSeq等系列型号测序仪；ion torrent的ion Proton测序仪；ABI的SOLID测序仪（已不在中国供货）；罗氏的454测序仪（已于2013年底停产）；
第3代测序仪：CG公司的CG测序系统（2013年被华大基因收购，有人认为CG不属于第3代测序仪）；太平洋生物公司的PacBio RSII测序仪等。
